bowtie2

基本命令

bowtie2-build ref1.fa bowtie2/ref1.fa
bowtie2 -x ref1.fa -U reads_1.fq
bowtie2 -x  bowtie2/ref1.fa -1 reads_1.fq -2 reads_2.fq 

docker run -it  --rm -v $PWD:$PWD -w $PWD  --user 1011:1011 registry.cn-hangzhou.aliyuncs.com/sj-bioinfo/bowtie2:2.5.1  bowtie2-build GRCh38.p14.genome.fa GRCh38.p14.genome.fa 

关键的参数

Presets:

• For --end-to-end:
  • --very-fast -D 5 -R 1 -N 0 -L 22 -i S,0,2.50
  • --fast -D 10 -R 2 -N 0 -L 22 -i S,0,2.50
  • --sensitive -D 15 -R 2 -N 0 -L 22 -i S,1,1.15 (default)
  • --very-sensitive -D 20 -R 3 -N 0 -L 20 -i S,1,0.50
• For --local:
  • --very-fast-local -D 5 -R 1 -N 0 -L 25 -i S,1,2.00
  • --fast-local -D 10 -R 2 -N 0 -L 22 -i S,1,1.75
  • --sensitive-local -D 15 -R 2 -N 0 -L 20 -i S,1,0.75 (default)
  • --very-sensitive-local -D 20 -R 3 -N 0 -L 20 -i S,1,0.50

Alignment:

• -N： max # mismatches in seed alignment; can be 0 or 1 (0)
• -L： length of seed substrings; must be >3, < 32 (22)
• -i： interval between seed substrings w/r/t read len (S,1,1.15)

Effort:

• -D： give up extending after failed extends in a row (15)
• -R： for reads w/ repetitive seeds, try sets of seeds (2)

• Bowtie 2
  • Bowtie 2 is particularly good at aligning reads of about 50 up to 100s or 1,000s of characters, and particularly good at aligning to relatively long (e.g. mammalian) genomes.
  • Bowtie 2 indexes the genome with an FM Index to keep its memory footprint small: for the human genome, its memory footprint is typically around 3.2 GB.
  • Bowtie 2 supports gapped, local, and paired-end alignment modes.

63778510 reads; of these:
  63778510 (100.00%) were paired; of these:
    5444376 (8.54%) aligned concordantly 0 times
    48955563 (76.76%) aligned concordantly exactly 1 time
    9378571 (14.70%) aligned concordantly >1 times
    ----
    5444376 pairs aligned concordantly 0 times; of these:
      821305 (15.09%) aligned discordantly 1 time
    ----
    4623071 pairs aligned 0 times concordantly or discordantly; of these:
      9246142 mates make up the pairs; of these:
        8363217 (90.45%) aligned 0 times
        399654 (4.32%) aligned exactly 1 time
        483271 (5.23%) aligned >1 times
93.44% overall alignment rate

((48955563 + 9378571 + 821305)*2 +  399654+ 483271)/127557020 = 0.9344354626660297

(63778510*2)-((48955563 + 9378571 + 821305)*2 +  399654+ 483271) = 8363217

以下是对 Bowtie2 比对结果的详细解读：

一、总体统计‌

• 总 reads 数量‌
  63,778,510 reads：表示输入的双端测序数据共包含 ‌6,377.85 万对 reads‌（每对含两条 reads）。

• 比对率‌
  93.44% overall alignment rate：表示 ‌93.44% 的 reads 至少有一条比对到参考基因组‌（包括单端比对和双端比对）。

二、双端比对分类‌

1. 一致性比对（Concordant Alignment）‌

• 未成功比对‌
  5,444,376 (8.54%) aligned concordantly 0 times：
  有 ‌544.44 万对 reads‌（8.54%）的双端均未按预期方向和距离比对到基因组。

• 唯一比对‌
  48,955,563 (76.76%) aligned concordantly exactly 1 time：
  4,895.56 万对 reads‌（76.76%）的双端均唯一比对到基因组，符合预期参数（如 --fr 方向）。

• 多重比对‌
  9,378,571 (14.70%) aligned concordantly >1 times：
  937.86 万对 reads‌（14.70%）的双端比对到基因组多个位置。

2. 不一致比对（Discordant Alignment）‌

• 未一致性比对中的部分成功‌
  821,305 (15.09%) aligned discordantly 1 time：
  在未一致性比对的 544.44 万对 reads 中，‌82.13 万对‌（15.09%）虽未满足一致性比对条件，但双端仍各自比对到基因组（如方向或间距不符）。
  三、单端比对统计‌

• 完全未比对‌
  4,623,071 pairs aligned 0 times：
  剩余 ‌462.31 万对 reads‌ 既未通过一致性比对，也未通过不一致比对。

• 单端比对成功率‌

• 8,363,217 (90.45%) aligned 0 times：
  836.32 万条单端 reads‌（占总 mates 的 90.45%）未比对到基因组。

• 399,654 (4.32%) aligned exactly 1 time：
  39.97 万条单端 reads‌（4.32%）唯一比对到基因组。

• 483,271 (5.23%) aligned >1 times：
  48.33 万条单端 reads‌（5.23%）比对到多个位置。

四、关键指标解读‌

五、建议‌
参数优化‌：若需减少多重比对，可调整 -k 或 -m 参数限制比对次数；
质量控制‌：检查未比对 reads 是否包含接头污染或低质量序列；
参考基因组验证‌：确认参考基因组版本与测序数据来源一致。